((شناساگرها))
در حالت کلی ، شناساگرها ماده ای رنگی است که معمولا از مواد گیاهی اخذ می‌شوند و می‌توانند به شکل اسیدی یا بازی موجودیت یابند. شناساگرها برای شناسایی اسیدها و بازها به ما کمک می‌کنند.
شناساگرها ، [برای دیدن لینک ها ابتدا باید عضو انجمن شوید. برای ثبت نام اینجا کلیک کنید...] با ساختار پیچیده هستند که به صورت اسید یا باز ضعیف عمل می‌کنند. واکنش‌های تفکیک و تجمع شناساگرها با نوآرایی ساختمانی درونی همراه است که سبب تغییر رنگ می‌شود.







برای تعیین نقطه پایان در حین تیتر کردن از ترکیبات شیمیایی مشخص استفاده می‌شود که در نزدیکی نقطه تعادل در اثر تغییر غلظت مواد تیترشونده شروع به تغییر رنگ می‌کنند. این ترکیبات ، مواد رنگی شناساگر می‌باشند. به عبارتی دیگر ، شناساگرها ماده ای رنگی هستند که رنگ آنها در محیط اسیدی و قلیایی با هم تفاوت دارد.
اطلاعات اولیه
انواع گوناگونی از ترکیبات ، هم سنتزی و هم طبیعی وجود دارند که بر حسب [برای دیدن لینک ها ابتدا باید عضو انجمن شوید. برای ثبت نام اینجا کلیک کنید...] محلولی که در آن حل می‌شوند، رنگ متفاوتی به خود می‌گیرند. بعضی از این مواد هزاران سال است که برای نشان دادن خصلت اسیدی یا بازی آب‌ها بکار گرفته شده‌اند. این ترکیبات همچنین برای شیمیدان عصر حاضر که از آنها برای تخمین PH محلول‌ها و تشخیص نقطه پایانی در [برای دیدن لینک ها ابتدا باید عضو انجمن شوید. برای ثبت نام اینجا کلیک کنید...] سود می‌برند، اهمیت زیادی دارند.


رنگ شناساگر
محلولی که محتوی یک شناساگر باشد، با تغییرات PH ، یک تغییر پیوسته در رنگ از خود ظاهر می‌سازد. لکن ، چشم انسان به این تغییرات حساس نیست. نوعا از یک گونه باید پنج تا ده برابر بطور اضافی موجود باشد تا رنگ آن گونه به چشم بیننده یک رنگ غالب به نظر آید. افزایش بیشتر در این نسبت هیچ تاثیر قابل روئیتی ندارد. فقط در ناحیه‌ای که نسبت از پنج تا ده برابر برای یک شکل به نسبت مشابهی برای یک شکل تغییر کند، بنظر می‌آید که رنگ محلول تغییر کرده است.
پس ، تغییر رنگ صوری شامل یک تغییر عمده در وضعیت تعادل شناساگر است. بعضی از شناساگرها نیاز به تغییر نسبت کمتری دارند و بعضی دیگر ، به تغییر بیشتر. بعلاوه ، تفاوت قابل توجهی نیز در توان افراد مختلف جهت تشخیص رنگ وجود دارد. در حقیقت ، شخص مبتلا به کور رنگی ممکن است قادر به تشخیص هیچ گونه تغییر رنگی نباشد.
دامنه PH برای تغییر رنگ
دامنه‌ای از PH که یک شناساگر معین در آن دامنه تغییر رنگ می‌دهد به ثبات [برای دیدن لینک ها ابتدا باید عضو انجمن شوید. برای ثبت نام اینجا کلیک کنید...] شناساگر بستگی دارد. برای شناساگرهایی که اسیدی ضعیف هستند هر اندازه ثابت یونش کوچکتر باشد، دامنه PH تغیر رنگ آن بالاتر است.
انواع شناساگر
معمولا می‌توان برای هر گسترده‌ای از PH ، شناساگری مناسب یافت. تعدادی از شناساگرهای معمولی در جدول زیر آمده‌اند.

نام شناساگر
گستره PH برای تغییر رنگ
رنگ اسیدی
رنگ قلیایی
آبی تیمول
1.2--2.8
قرمز
زرد
آبی تیمول
8.0--9.6
زرد
آبی
زرد متیل
2.9--4.0
قرمز
زرد
نارنجی متیل
3.1--4.4
قرمز
زرد
سبز برموکرزول
3.8--5.4
زرد
آبی
قرمز متیل
4.2--6.3
قرمز
زرد
کاغذ تورنسل(لیتموس)
.50--8.0
قرمز
آبی
آبی ترموتیمول
6.0--7.6
زرد
آبی
قرمز فنول
6.4--8.0
زرد
قرمز
فنل فتالین
8.0--9.6
بی رنگ
قرمز
زرد آلیزارین
10.1--12..0
بی رنگ
بنفش



شناساگرهای فتالین
اکثر شناساگرهای فتالین (فتالئین) در محلول‌های اسیدی ملایم ، بی‌رنگ‌اند، و در محیط قلیایی رنگهای گوناگونی از خود ظاهر می‌کنند. در محلول‌های قلیایی شدید ، رنگ این شناساگر بتدریج محو می‌شود که در بعضی از کاربردها این امر پدیده نامناسبی است و بصورت یک گروه ، فتالین‌ها در [برای دیدن لینک ها ابتدا باید عضو انجمن شوید. برای ثبت نام اینجا کلیک کنید...] بسختی حل می‌شوند و حلال معمولی این گروه از شناساگرها ، [برای دیدن لینک ها ابتدا باید عضو انجمن شوید. برای ثبت نام اینجا کلیک کنید...] است. معروفترین شناساگر فتالین ، فنل فتالین است.
شناساگرهای سولفون فتالین

بسیاری از سولفون فتالین‌ها ، دو گستره تغییر رنگ مفید دارند. یکی در محلول‌های نسبتا اسیدی و دیگری در [برای دیدن لینک ها ابتدا باید عضو انجمن شوید. برای ثبت نام اینجا کلیک کنید...] یا بازی ملایم واقع می‌شود. برخلاف فتالین‌ها ، رنگ بازی این گروه در محیط قلیایی پایدار است. بواسطه قدرت اسیدی قابل توجه سولفون فتالین (سولفون فتالئین) ، معمولا از نمکهای سدیم آنها جهت تهیه محلول شناساگرها استفاده می‌شود.
ساده‌ترین شناساگر از گروه سولفون فتالین ، فنل سولفون فتالین است که به نام قرمز فنول معروف است.



شناساگرهای آزاد
اکثر شناساگرهای آزاد با افزایش قدرت بازی ، یک تغییر رنگ از قرمز زرد از خودشان می‌دهند. گستره انتقال آنها عموما در قسمت اسیدی است. نمونه‌هایی که بیشترین برخورد را با آنها داریم عبارتند از نارنجی مبیل و قرمز متیل(متیل اورانژ).

متغییرهای موثر بر رفتار شناساگرها
فاصله‌ای از PH که در آن یک شناساگر معین تغییر رنگ می‌دهد با [برای دیدن لینک ها ابتدا باید عضو انجمن شوید. برای ثبت نام اینجا کلیک کنید...] ، قدرت یونی محیط ، حضور حلال‌های آلی و حضور [برای دیدن لینک ها ابتدا باید عضو انجمن شوید. برای ثبت نام اینجا کلیک کنید...] تغییر می‌کند. بعضی از این عوامل ، بخصوص دو مورد آخر ، می‌توانند موجب جابجایی این فاصله به اندازه یک واحد PH یا بیشتر شوند.






کاربرد شناساگرها
یکی از ساده ترین راه تخمین کمی [برای دیدن لینک ها ابتدا باید عضو انجمن شوید. برای ثبت نام اینجا کلیک کنید...] ، استفاده از یک شناساگر است. با افزودن مقدار کمی از یک شناساگر به یک محلول ، تشخیص اسیدی یا بازی بودن آن ممکن می‌شود. در صورت مشخص بودن PH ، تغییر شناساگر از یک شکل به شکل دیگر ، با توجه به رنگ مشاهده شده ، می‌توان تعیین کرد که PHمحلول کم‌تر یا بیشتر از این مقدار است. شیمیدان‌ها از این گونه مواد برای شناسایی اسیدها و بازها کمک می‌گیرند.
شناساگرهای زیادی وجود دارد که معروفترین آنها لیتموس (تورنسل) است که در محیط اسیدی ، قرمز ، در محیط بازی ، آبی و در حدود خنثی بنفش رنگ است. تغییر رنگ آن در نزدیکی [برای دیدن لینک ها ابتدا باید عضو انجمن شوید. برای ثبت نام اینجا کلیک کنید...] برابر 7 رخ می‌دهد. در هر حال تغییر رنگ ناگهانی نیست. فنل فتالئین ، معرف دیگری است که بیشتر برای بازها قابل استفاده است. این ماده جامدی سفید رنگ است که در آزمایشگاه محلول الکلی آن را بکار می‌برند. این محلول در محیط اسیدی رنگ و در محیط قلیایی رقیق ارغوانی است.
می‌توان از آب کلم سرخ نیز به‌عنوان یک شناساگر اسید و باز استفاده کرد. از آمیختن شناساگرهای مختلف با یکدیگر نوار کاغذی بدست می‌آید که با یک مقیاس رنگ مقایسه‌ای همراه است و برای اندازه گیری‌های تقریبی PH بطور گسترده کاربرد دارد.
انواع شناساگرها
دو نوع شناساگر داخلی و خارجی را معرفی می‌کنیم:
شناساگر داخلی
اگر به محلول تیتر شونده ، چند قطره از یک شناساگر افزوده شود و پس از پایان عمل تغییر رنگ در محلول ایجاد شود، چنین شناساگری را شناساگر داخلی یا درونی نامند.
شناساگر خارجی
در برخی حالات قبل از آن که نقطه پایان به ظهور برسد، بین شناساگر و محلول تیتر شونده یک واکنش صورت می‌گیرد و در این حالت نقطه پایان بسیار سریع پدیدار می‌شود، مثل تیتر کردن فسفات با استات اورانیل در حضور شناساگر فروسیانور پتاسیم ، فروسیانور پتاسیم با یونهای اورانیل قبل از رسیدن به نقطه پایان [برای دیدن لینک ها ابتدا باید عضو انجمن شوید. برای ثبت نام اینجا کلیک کنید...] می‌دهد.

برای بدست آوردن نتیجه صحیح و خوب باید به دفعات لازم چند قطره از محلول بالای رسوب ( یا محلولی که پس از صاف کردن رسوب بدست می‌آید ) را در فاصله زمانهای مساوی ، روی یک قطعه کاغذ صافی با شناساگر سیانور پتاسیم آزمایش کرد. چنین شناساگری ، شناساگر خارجی نامیده می‌شود.
فاصله تغییر PH و تغییر رنگ برخی از شناساگرهای مهم اسید و باز که متداولند و جدول زیر آمده است:
نام متداول
فاصله PH برای تغییر رنگ
رنگ اسید
رنگ باز
نوع شناساگر
لیتموس (تورنسل)
8- 5/5
قرمز
آبی
آبی متیل
3/2- 2/1
قرمز
زرد
بنفش متیل
2- 0
زرد
بنفش
آبی تیمول
6/9-8
زرد
آبی
اسیدی
زرد متیل
4-9/2
قرمز
زرد
بازی
نارنجی متیل
4/4-1/3
قرمز
زرد
بازی
سبزبرموکرزول
4/5- 8 /3
زرد
آبی
اسیدی
قرمز متیل
3/6-2/4
قرمز
زرد
بازی
قرمز کلروفنول
4/6-8/4
زرد
قرمز
اسیدی
آبی برموتیمول
6/7-0/ 6
زرد
آبی
اسیدی
قرمزفنول
8-4/6
زرد
قرمز
اسیدی
قرمز خنثی
8-8/6
قرمز
زرد- نارنجی
بازی
ارغوانی کرزول
9-4/7
زرد
ارغوانی
اسیدی
فنل فتالئین
6/9-8
بی‌رنگ
قرمز
اسیدی
تیمول فتالئین
5/10-3/9
بی‌رنگ
آبی
اسیدی
زرد آلیزارین
12-1/10
زرد
قرمز
بازی



اسیدها - بازها و شناسایی انها از یکدیگر
روش اول : برخي از بازها و اسيد هاي خوراكي را با توجه به مزه آنها مي توان از هم تشخيص داد.

روش دوم:استفاده از شناساگر ( معرف ) ها ، شناساگرها مواد طبيعي يا شيمايي هستند كه با تغيير رنگ خود در محيط اسيدي و در محيط بازي اين دو دسته از مواد را از يكديگر متمايز مي سازنند.

شناساگر هاي طبيعي : در گذشته از عصاره گل يا ميوه گياهان براي شناسايي اسيد ها و بازها از يكديگر استفاده مي كردند.مثلا از عصاره كلم سرخ ، گلبرگ هاي گل بنفشه ، گلبرگ هاي گل سرخ ، كه آنها را روي يك قطعه اي از يك كاغذ كشيده تا قرار گيرد و با پاشيدن مقداري از اسيد يا باز تغيير رنگ ايجاد مي شد كه اين عامل شناسايي مواد از يكديگر بود.

شناساگرهاي شيميايي: از شناساگرهاي شيمايي مي توان ليتموس (تورنسل) ، فنول فتالئين و متيل اورانژ(متيل نارنجي) را را نام برد.جدول زير تغيير رنگ اين سه شناساگر را در محيط اسيدي و بازي نشان مي دهد.

فاصله تغییر PH و تغییر رنگ برخی از شناساگرهای مهم اسید و باز که متداولند و جدول زیر آمده است:
[برای دیدن لینک ها ابتدا باید عضو انجمن شوید. برای ثبت نام اینجا کلیک کنید...]
رنگ اسیدی
دامنه PH برای تغییر رنگ
رنگ قلیایی
آبی تیمول
قرمز
1.2 - 2.8
زرد
متیل اورانژ
قرمز
3.1 - 4.5
زرد
سبز برموکروزول
زرد
3.8 - 5.5
آبی
سرخ متیل
قرمز
4.2 - 6.3
زرد
لیتموس
قرمز
5 - 8
آبی
آبی برم‌تیمول
زرد
6 - 7.6
آبی
آبی تیمول
زرد
8 9.6
آبی
فنل فتالین
بی‌رنگ
8.3 - 10
قرمز
زرد آلیزارین
زرد
10 - 12.1
ارغوانی کم رنگ
تیمول فتالئین
بی‌رنگ
9.3 - 10.5
آبی
ایندوفنول
قرمز
7.1 - 9.1
آبی
برموفنول آبی
زرد
3 - 4.6
ارغوانی
مالاشیت سبز
زرد
آبی
0 - 2
11
.5 - 14
سبز
بی‌رنگ
آزو بنفش
زرد
13 - 11
بنفش
متیل بنفش
زرد
0.15 - 3.2
بنفش

روش سوم: استفاده از عامل PH ( پي اچ). PH مقياسي است كه در ماي اتاق گستره اي از صفر تا 14 را در بر مي گيرد با اين عامل هم اسيد ي يا بازي بودن محلول ها و هم ميزان اسيدي يا بازي بودن را مي توانيم مشخص كنيم. PH در واقع منفي لگاريتم غلظت يون هيدرونيوم است كه توسط دانشمندي به نام سورن پيتر لاريتس سورن سن زيست شيمي دان دانماركي نهاده شد .

PH = - Log[H3O+]

آب خالص ومحلول ها خنثي مانند آب نمك ،آب قند داراي PH برابر 7 اند و محلول هاي اسيدي PH كمتر از 7 و محلول هاي بازي PH بيشتر از 7 را دارند. در اسيدها هرچه مقدار PH كمتر باشد قدرت اسيدي بيشتر و در بازها هر چه PH بيشتر باشد قدرت بازي بيشتر است.

PH محلول ها را مي توان به كمك كاغذ هاي PHسنج يا به كمك دستگاه PH سنج ديجيتالي سنجيد.

تیمول . (فرانسوی ، اِ) تیمل یا اسیدتیمیک که بصورت بلورهای درشت بیرنگ با بوی مخصوص است . نقطه ٔ ذوب آن50تا51درجه و نقطه ٔ جوش آن232درجه است . در آب بسیار کم محلول است .



کاربرد شناساگرها
یکی از ساده ترین راه تخمین کمی
PH ، استفاده از یک شناساگر است. با افزودن مقدار کمی از یک شناساگر به یک محلول ، تشخیص اسیدی یا بازی بودن آن ممکن می‌شود. در صورت مشخص بودن PH ، تغییر شناساگر از یک شکل به شکل دیگر ، با توجه به رنگ مشاهده شده ، می‌توان تعیین کرد که PH محلول کم‌تر یا بیشتر از این مقدار است. شیمیدان‌ها از این گونه مواد برای شناسایی اسیدها و بازها کمک می‌گیرند.
شناساگرهای زیادی وجود دارد که معروفترین آنها لیتموس (تورنسل) است که در محیط اسیدی ، قرمز ، در محیط بازی ، آبی و در حدود خنثی بنفش رنگ است. تغییر رنگ آن در نزدیکی
PH برابر ۷ رخ می‌دهد. در هر حال تغییر رنگ ناگهانی نیست. فنل فتالئین ، معرف دیگری است که بیشتر برای بازها قابل استفاده است. این ماده جامدی سفید رنگ است که در آزمایشگاه محلول الکلی آن را بکار می‌برند. این محلول در محیط اسیدی رنگ و در محیط قلیایی رقیق ارغوانی است.
می‌توان از آب کلم سرخ نیز به‌عنوان یک شناساگر اسید و باز استفاده کرد. از آمیختن شناساگرهای مختلف با یکدیگر نوار کاغذی بدست می‌آید که با یک مقیاس رنگ مقایسه‌ای همراه است و برای اندازه گیری‌های تقریبی
PH بطور گسترده کاربرد دارد.
انواع شناساگرها
دو نوع شناساگر داخلی و خارجی را معرفی می‌کنیم:
شناساگر داخلی
اگر به محلول تیتر شونده ، چند قطره از یک شناساگر افزوده شود و پس از پایان عمل تغییر رنگ در محلول ایجاد شود، چنین شناساگری را شناساگر داخلی یا درونی نامند.

شناساگر خارجی
در برخی حالات قبل از آن که نقطه پایان به ظهور برسد، بین شناساگر و محلول تیتر شونده یک واکنش صورت می‌گیرد و در این حالت نقطه پایان بسیار سریع پدیدار می‌شود، مثل تیتر کردن فسفات با استات اورانیل در حضور شناساگر فروسیانور پتاسیم ، فروسیانور پتاسیم با یونهای اورانیل قبل از رسیدن به نقطه پایان واکنش می‌دهد. >
برای بدست آوردن نتیجه صحیح و خوب باید به دفعات لازم چند قطره از محلول بالای رسوب ( یا محلولی که پس از صاف کردن رسوب بدست می‌آید ) را در فاصله زمانهای مساوی ، روی یک قطعه کاغذ صافی با شناساگر سیانور پتاسیم آزمایش کرد. چنین شناساگری ، شناساگر خارجی نامیده می‌شود

رنگ آمیزی گرم و متیل بلو
برای شناسایی باکتری ها روش های رنگ آمیزی متفاوتی از قبیل LCBP ، گمیسا ، اسید فاست و گرم وجود دارد.
رنگ ‌آمیزی گرم ( Gram staining) یکی از مهم‌ترین ومتداولترین روش‌های رنگ آمیزی در باکتری‌شناسی است که اولین بار توسط کریستین گرم ابداع شد. دراین رنگ آمیزی باکتری‌ها بر مبنای رنگ باکتری پس ازرنگ آمیزی به دودسته گرم مثبت و گرم منفی تقسیم می‌شوند.
رنگ باکتری پس ازرنگ آمیزی به توانایی حفظ رنگ اول وبه عبارتی به ساختمان دیواره سلولی باکتری بستگی دارد. دررنگ آمیزی گرم باکتری‌های گرم مثبت پس ازرنگ آمیزی به رنگ بنفش وباکتری‌های گرم منفی به رنگ قرمز مشاهده می‌شود. گرچه هر دو گروه یعنی باکتری‌های گرم مثبت و منفی دارای دیواره می‌باشند ولی فرق بین این دو گروه مربوط به خواصی است که در ساختمان دیواره سلولی آنها وجود دارد. اساس ساختمان در دیواره سلولی باکتری‌های گرم مثبت یک لایه ضخیم از پپتیدوگلیکان است، ولی در باکتری‌های گرم منفی ضخامت آن به حداقل می‌رسد.
از رنگ آمیزی گرم در دو جهت استفاده می شود:

1.شناسایی جنس باکتری
۲.انتخاب آنتی بیوتیک مناسب (باکتری های گرم مثبت در مقایسه با باکتری های گرم منفی نسبت به پنی سیلین G حسّاسیت بیشتری دارند)
با این حال همه باکتری ها را نمی توان با رنگ امیزی گرم مشاهده نمود. فهرستی از باکتری های مهم از نظر پزشکی که با رنگ امیزی گرم قابل مشاهده نیستند در جدول زیر امده است :
باکتری های مهم از نظر پزشکی که با رنگ آمیزی گرم قابل مشاهده نیستند

نام باکتری
علّت عدم مشاهده باکتری با روش گرم
روش رنگ آمیزی جایگزین
1
مایکو باکتریوم ها شامل مایکو باکتریوم توبرکلوزیس
وجود مقدار زیادی چربی در دیواره سلولی که از نفوذ رنگ جلوگیری می کند
رنگ امیزی اسید فاست
2
ترپونما پالیدوم
نازکتر از آن است که دیده شود
میکروسکوپ زمینه تاریک یا آنتی بادی فلوئورسنت
3
مایکوپلاسما پنومونیه
نبود دیواره سلولی
روشی وجود ندارد
4
لژیونلّا پنومونیه
عدم دریافت رنگ قرمز
طولانی نمودن مرحله افزودن سافرانین در رنگ امیزی گرم
5
کلامیدیا ها از جمله کلامیدیا تراکوماتیس
وجود ارگانیسم های درون سلولی، کوچکی سلول
...............
6
ریکتزیا ها
وجود ارگانیسم های درون سلولی، کوچکی سلول
رنگ آمیزی گیمسا یا سایر رنگ آمیزی های بافتی


آزمایش :
در این سکشن ، دو نوع رنگ امیزی انجام دادیم ؛ رنگ آمیزی گرم و رنگ آمیزی متیل بلو.
همانطور که در قبل توضیح داده شد ، رنگ آمیزی گرم برای شناسایی نوع باکتری انجام می گیرد. در اینجا رنگ آمیزی متیل بلو هم اریم که فقط برای مشاهده بهتر باکتری ها انجام می شود و در این حالت تمام لایه خارجی ، رنگ می گیرد و می توانیم باکتری ها را مشخص تر ببینیم.
ابزار و مواد مورد نیاز برای آزمایش:
آنس حلقوی ، لام ، گیره ، سینی رنگ آمیزی ، پلیت حاوی باکتری ، لوگول ، کریستال ویوله ، سافرانین ، الکل- استون ، متیل آبی
شرح آزمایش:
ابتدا برای هر رنگ آمیزی یک گسترش تهیه کنیم. برای تهیه گسترش ابتدا آنس حلقوی را روی شعله می گیریم تا عاری از باکتری شود ، سپس به وسیله همین آنس یک قطره آب روی لام قرار می دهیم. به وسیله آنس حلقوی مقداری از باکتری های کشت شده را از پلیت بر می داریم ( البته این کار باید کنار شعله انجام گیرد) و در قطره آب روی لام حل می کنیم. پس از این کار لام را کنار می گذلریم تا خشک شود.
بعد از این مرحله نوبت به ثابت کردن می رسد. برای این کار کافیست لام ها را روی شعله بگیریم تا کمی لام داغ شود.
تا این مرحله برای هر دو رنگ آمیزی یکسان بود. حال به شرح هر نوع رنگ آمیزی می پردازیم.
رنگ آمیزی گرم: ابتدا لام آماده را روی سینی رنگ آمیزی قرار می دهیم. چند قطره کریستال ویوله روی باکتری ها می ریزیم و به مدت تقریبا یک دقیقه صبر می کنیم ، در طی این مدت همه باکتری ها بنفش رنگ خواهند شد. پس از شستشوی فروتی با آب ، کریستال ویوله را با افزودن لوگول به مدت یک دقیقه تثبیت می کنیم. لوگل باکریستال ویوله ترکیب شده وایجاد کمپلکس‌هایی می‌نمایید که باعث تثبیت رنگ کریستال ویوله درداخل دیواره سلولی باکتری می‌شود. پس ازاین مرحله، همه باکتریها کماکان به رنگ بنفش مشاهده می‌شوند. پس از این مدت لام را با آب شستشو می دهیم.
حال نوبت به مرحله ی رنگ زدایی می رسد که مهمترین مرحله رنگ آمیزی است. در اینجا ما از الکل استون برای این کار استفاده کردیم. لام را شیب دار قرار می دهیم و روی آن الکل استون می ریزیم تا زمانی که آخرین قطره بنفش رنگ از لام خارج شود ( به طور معمول نباید این شستشو بیش از 30 ثانیه به طول انجامد زیرا سبب تغییر رنگ می شود). درباکتریهای گرم منفی که دارای لایه‌های پپتیدو گلیکان محدود وغشای خارجی غنی از چربی هستند این حلال باعث حذف این لایه‌ها وغشا می‌گردد وباکتری رنگ مراحل قبل راازدست می‌دهد. ولی درباکتریهای گرم مثبت به علت ضخامت زیاد لایه ی پپتیدوگلیکانی وعدم وجود لیپید فراوان در غشا رنگ مرحله قبل ازغشا خارج نمی‌شود .درنتیجه پس ازاین مرحله باکتریهای گرم منفی بی رنگ ولی باکتریهای گرم مثبت کماکان بنفش باقی خواهند ماند.
در آخر پس از شستشوی لام با آب نوبت اضافه کردن سافرنین می رسد که به مدت 30 ثانیه آن را روی فروتی قرار می دهیم. پس از این کار لام را با آب شستشو می دهیم و پس از خشک شدن با میکروسکوب بررسی می کنیم. برای خشک کردن می توانیم برای سرعت کار از گرمای لامپ استفاده کنیم. دراین مرحله باکتری‌های بی رنگ (باکتری های گرم منفی) به رنگ قرمز درمی‌آیند وباکتری‌های بنفش (باکتری های گرم مثبت) بدون تغییر رنگ باقی می‌مانند.
رنگ آمیزی متیل آبی: لام را روی سینی رنگ آمیزی می گذاریم و متیل آبی را روی فروتی می ریزیم ، پس از یک دقیقه لام را با آب شستشو می دهیم. پس از خشک شدن می توانیم لام را با میکروسکوب مشاهده کنیم.




آلیزارین
Alizarene


به فرمول C14H8O4 و به وزن ملکولی 20/240 است. از ریشه روناس به دست می آید. آلیزارین با دو ملکول گلوکز ایجاد اسید روبه ریتریک و دو ملکول آب می نماید. آلیزارین نخستین بار در سال 1833 میلادی توسطRobiquet , Colin شناخته شد. آلیزارین به حالت آزاد در ریشه خشک روناس وجود دارد. به طوریکه با تأثیر دادن الکل جوشان، می توان آنرا استخراج کرد. در حالی که از ریشه تازه گیاه، این ماده به صورت بلورهایی سوزنی شکل ارتورومبیک و به رنگ نارنجی در الکل مطلق با روش تصعید متبلور می گردد. در گرمای 290 درجه ذوب می شود و قابلیت تصعید شدن دارد.در 300 قسمت آب جوش و به مقدار متوسط ، در الکل حل می گردد. به مقادیر زیاد در متانول خیلی گرم و در اتر در گرمای 25 درجه محلول است. در تولوئن، گزیلن، سولفوروکربن و اسیداستیک گلاسیال حل می شود
معرفهای PH یا شناساگرهای شیمیایی اسید و باز ، ترکیبات رنگی یا غیر رنگی آلی با وزن مولکولی بالا هستند که در آب یا حلال‌های دیگر به دو صورت اسیدی و بازی وجود دارند.
بهترین شناساگرهای اسید - باز ، اسیدهای آلی ضعیف می‌باشند. شکل اسیدی شناساگر رنگ مشخصی دارد و در صورت از دست دادن پروتون ، به ترکیب بازی که دارای رنگ دیگری می‌باشد، تبدیل می‌شود. یعنی تغییر رنگ اغلب شناساگرها از محلول بستگی به تغییر شکل آنها دارد. با استفاده از شناساگرها می‌توان
PH یک محلول را تعین کرد شناساگرهای مختلفی برای تعیین PH شناخته شده‌اند که هر یک در محدوده خاصی از PH تغییر رنگ می‌دهند.

چگونگی تغییر رنگ یک شناساگر
شناساگرها ، اسیدها یا بازهای ضعیفی هستند و چون اکثر آنها شدیدا رنگی هستند، در هر اندازه گیری
PH چند قطره از محلول رقیق شناساگر کافی می‌باشد. شناساگرهای اسید - باز را معمولا به صورت HIn نشان می‌دهند.

فرم اسیدی
HIn ↔ H+ + -In فرم بازی

(
Ka = (H+)x(In-)/(HIn)

اگر محلولی شامل دو جزء رنگی
A و B باشد، معمولا رنگ A در مخلوط وقتی توسط چشم انسان تشخیص داده می‌شود که شدت آن ، ده برابر بیشتر از شدت رنگ B باشد، چون شدت آن تابع غلظت است. بنابراین رنگ ترکیب اسیدی شناساگر زمانی قابل رویت است که :

(10
In-) = (HIn)

و رنگ و ترکیب بازی شناساگر زمانی قابل مشاهده است که:

(
In-) = 10(HIn)
انتظار می‌رود وقتی که (In-) = (HIn) می‌باشد، رنگ شناساگر حد واسط بین دو رنگ باشد. در آن نقطه ویژه :
Ka شناساگر برابر غلظت +H و PKa= PH است. در نتیجه PH ای که در آن یک شناساگر که PKa آن نزدیک PH نقطه هم‌ارزی تیتراسیون است، تغییر رنگ شناساگر در نزدیک نقطه تعادل ، امکان‌پذیر می‌باشد.

اهمیت استفاده از شناساگر مناسب در تیتراسیون
با استفاده از انواع شناساگر ، می‌توان
PH یک محلول را تعیین کرد. برای این کار لازم است محدوده PH تغییر رنگ شناساگر را بدانیم. در تیتراسیونهای اسید و باز هم لازم است که PKa شناساگر مورد استفاده به PH محلول مورد نظر نزدیک باشد، در غیر اینصورت آزمایش همراه با خطا خواهد بود. اگر شناساگر قبل از نقطه هم‌ارزی تغییر رنگ دهد، حجم نقطه پایان کمتر از نقطه هم‌ارزی (خنثی شدن اسید یا باز) است و اگر شناساگر بعد از نقطه هم ارزی تغییر رنگ دهد، حجم نقطه پایان بیشتر از نقطه هم ارزی است.

در برخی از موارد مخلوطی از دو یا چند شناساگر در یک تیتراسیون مصرف می‌شود تا تغییر رنگ مشخصی در نقطه پایان رخ دهد. بعنوان مثال می‌توان متیلن آبی را با متیلن قرمز مخلوط کرده و یک شناساگر مخلوط بوجود آورد که در
PH حدود 5.4 از بنفش به سبز تغییر رنگ می‌دهد. در این مورد ، متیلن آبی حین تیتراسیون بدون تغییر رنگ می‌ماند. اما متیلن قرمز در PHهای ‌کمتر از حدود 5.4 قرمز و در PHهای بیشتر از حدود 5.4 زرد می‌باشد.
در
PHهای ‌کمتر ، قرمز و آبی ترکیب شده و رنگ بنفش ایجاد می‌کنند و در PHهای بیشتر ، زرد و آبی ترکیب شده و رنگ سبز ایجاد می‌کنند. دیدن تغییر رنگ بنفش به سبز ، آسانتر از تشخیص تغییر رنگ قرمز به زرد در شناساگر متیلن سرخ تنهاشت.
غلظت بالای شناساگر در محیط سبب ایجاد خطا در تیتراسیون می شود چون شناساگرها درواقع خودشان اسید و بازهای ضعیفی هستند که چنانچه به میزان بیشتر در محیط قرار گیرند باعث خطا در نتیجه ی تیتراسیون می شوند.
هر شناساگری برای یک تیتراسیون مناسب تر است. مثلاً فنل فتالئین برای تغییر در بازه ی 7 تا 11 مناسب است. محدوده ی شناساگرهای دیگر عبارتند از:
در گستره ی 1 تا 8/2 شناساگر آبی تیمول کاربرد دارد. رنگ در ابتدای بازه قرمز و در انتهای آن زرد می باشد.
در گستره ی 3 تا 7/4 شناساگر آبی برموفنول کاربرد دارد. رنگ در ابتدای بازه نارنجی مایل به زرد و در انتهای آن بنفش می باشد.
در گستره ی 4/5 تا 8/6 شناساگر ارغوانی برموکرزول کاربرد دارد. رنگ در ابتدای بازه سبز مایل به زرد و در انتهای آن بنفش می باشد.
در گستره ی 1/5 تا 5/6 شناساگر قرمز پروپیل کاربرد دارد. رنگ در ابتدای بازه صورتی و در انتهای آن زرد می باشد.
در گستره ی 1/7 تا 8/8 شناساگر قرمز کرزول کاربرد دارد. رنگ در ابتدای بازه زرد و در انتهای آن بنفش می باشد.
آلیزارین دارای فرمول مولكولی
C14H8O4 می‌باشد. چند نوع آلیزارین وجود دارد: آلیزارین زرد GC با نام لاتین Alizarinyellow GC برای مشخص نمودن ناحیه بازی مورد استفاده قرار می‌گیرد. در محیط بازی با محدوده Ph از 10 تا 12 رنگ این معرف از بیرنگ به زرد تغییر می‌كند.
نوع دیگر آلیزارین با نام آلیزارین قرمز
Alizarin red S ، فرم اسیدی آن قرمز و فرم بازی آن زرد می‌باشد. فرم خنثی این معرف، نارنجی رنگ می‌باشد. این معرف در ناحیه Ph از 4/6 تا 4/4 از زرد به قرمز تغییر رنگ می‌دهد
كاربرد برمو تيمول بلوBromothymol Blue(BTB) در زيست شناسي

:برم تيمول بلو يك معرف(معرف PH) شيميائي است كه براي تشخيص اسيدها و بازهاي ضعيف مورد استفاده قرار مي گيرد(ph نزديك به خنثي يعني بين 6(زرد رنگ) تا 7.6 (آبي رنگ)).برم تيمول بلو در محلولهاي خنثي به رنگ سبز مي باشد و در محلولهاي اسيدي زردرنگ و در محلولهاي بازي آبي رنگ مي شود.وقتي به آن دي اكسيد كربن اضافه شود زرد رنگ مي شود.البته نمي توان گفت برم تيمول بلو معرف دي اكسيد كربن است چون در تمام محلولهاي اسيدي زرد رنگ مي شود اما چون واكنش دي اكسيد كربن با آب توليد اسيد كربنيك(اسيد ضعيف) مي كند كه نوعي اسيد است بنا براين باعث تغيير رنگ برم تيمول بلو ميگردد.استفاده از آب آهك به عنوان معرف دي اكسيد كربن بهتر و اختصاصي تر از برم تيمول بلو مي باشد.برم تيمول بلو به عنوان يك رنگ براي رنگ كردن بافت هاي گياهي(ديواره سلولي و هسته ها) نيز مورد استفاده قرار مي گيرد.از برم تيمول بلو در تانكهاي پرورش ماهي براي تعيين ميزان كربنيك اسيد آن استفاده مي شود.